В настоящее время GFP и его варианты и гомологи различных цветов используются в различных областях молекулярной и клеточной биологии. ФБ широко распространены как неинвазивные метки для изучения различных биологических моделей от отдельных молекул до клеток и целого организма. Использование ФБ позволяет проследить практически весь путь жизни исследуемого белка: его экспрессию, локализацию, движение, взаимодействие с другими белками и активность в клетке, расположение в ткани или организме. В число основных применений ФБ входят:
- изучение регуляции активности промотора исследуемого гена
- мечение белков
- обнаружение белок-белковых взаимодействий
- прослеживание движения белков
- наблюдение за изменением определенных клеточных параметров с помощью флуоресцентных сенсоров на основе ФБ
Флуоресцентные метки широко используются для наблюдения за активностью промоторов исследуемых генов. Ген, кодирующий ФБ, помещается под контроль промотора-мишени, благодаря чему за активностью промотора легко следить по изменению флуоресцентного сигнала. Флуоресцентные белки позволяют проводить наблюдение за промоторами во времени. Также таймеры могут быть использованы для наблюдения за динамикой экспрессии генов в различных тканях, для наблюдения за белковым транспортом, и для анализа распределения органелл в зависимости от времени их возникновения. Флуоресцентные белки нашли широкое применение в качестве меток клеточных компартментов, органелл и отдельных белковых молекул in vivo. Для направления флуоресцентных белков в определённую часть клетки в последовательность белка вводятся соответствующие сигналы, а для исследования локализации и перемещения исследуемых белков создаются химерные молекулы, где C- или N-конец флуоресцентного белка соединён с белком-мишенью полипептидным линкером в одной рамке считывания. Основной проблемой в таких экспериментах является тенденция большинства GFP подобных белков к олигомеризации, что может значительно влиять на сохранение активности исследуемого белка и приводить к формированию токсичных агрегатов. В связи с этим при создании химерных белков предпочтение отдаётся мономерным флуоресцентным белкам. Для получения достоверных результатов также необходим нативный фолдинг как флуоресцентного белка, так и белка-мишени, поэтому важным является правильный подбор длины линкера и учёт возможных стерических взаимодействий между частями химерной молекулы. Изучение флуоресцирующих белковых химер с помощью этих методов позволяет вычислить коэффициент активной диффузии (Deff) и определить мобильную фракцию белка (Mf). За последние несколько лет значительный прогресс был достигнут в разработке так называемых фотоактивируемых флуоресцентных белков (ФАФБ). Фотоактивация может происходить различными путями: за счет увеличения квантового выхода флуоресценции или молярного коэффициента поглощения при данной длине волны, а также за счет смещения максимума длины волны возбуждения и/или эмиссии флуоресценции. Первый белок такого типа – фотоактивируемый хромобелок asFP595 морского анемона Anemonia sulcata – был описан в 2000 г. Облучение этого белка интенсивным зеленым светом переводит его в красное флуоресцентное состояние за счет увеличения квантового выхода флуоресценции более чем в 100 раз. Белок возвращается в исходное состояние за несколько секунд в темноте или под воздействием синего света. Настоящий прорыв во флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения произошел за последние несколько лет с использованием фотоактивируемых красителей. Сегодня разрешение достигает 20-50 нм, что существенно превосходит фундаментальный барьер разрешения классической световой микроскопии. За флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения, в том числе с использованием ФАФБ, в 2014 году была присуждена Нобелевская премия по химии